一、质粒的基本构型
质粒的粗提取物通常包含三种主要构型的质粒DNA:共价闭合环状DNA(cccDNA),这是质粒DNA最常见的形式。当质粒的两条链完整地环绕在一起时,形成具有高度稳定性和完整性的闭环结构,广泛应用于基因工程中。在电泳分析中,这些结构的迁移速度从快到慢依次为:超螺旋DNA、线性DNA和开环DNA。
二、质粒提取方法
质粒提取过程主要目的是去除RNA,并将质粒与细菌基因组DNA分离,去掉蛋白质和其他杂质,以获得相对纯净的质粒。质粒提取通常包括三个步骤:菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA,及质粒DNA的分离与纯化。常见的提取方法有碱裂解法、煮沸裂解法、小量一步提取法、试剂盒法、酶解法等。这些方法可根据产量分为小提、中提和大提。
1) 碱裂解法
该方法通常依赖于一些常见的质粒提取试剂盒,如OMEGA、BIOMIGA、Sigma、TaKaRa、Promega等,这些品牌多在碱裂解法的基础上进行优化。原理是利用共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学差异进行分离。在强碱环境下,细菌细胞壁和细胞膜被破坏,基因组DNA和质粒DNA被释放。而后,线性DNA的双螺旋结构受到破坏,质粒DNA则能在酸性条件下迅速复性,利于后续的分离和纯化。这一方法操作简便,成本低,适用于大多数常规实验,尽管提取的纯度可能需要进一步的纯化。
2) 煮沸法
此法通过将细菌悬浮于含有Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中,加热至100℃进行裂解。该方法能够有效地处理小于15kb的小质粒,适用于不同规模的菌液提取。其优点在于操作简单,时间短,但由于条件较为严格,易造成质粒断裂,回收率相对较低。
3) 小量一步提取法
此方法利用细菌染色体DNA在机械力作用下被震断,同时质粒DNA则在机械力消失后迅速复性,形成可溶性的状态,通过高速离心能够有效分离质粒DNA。
4) 试剂盒法
通常采用改良的SDS-碱裂解法,通过硅胶膜在特定条件下结合DNA实现快速纯化。其特点为产率高、适用面广、处理速度快、纯度高,尤其是在生物医学研究中受到青睐。
5) 酶解法
利用特异性酶来裂解细胞壁或细胞膜,释放质粒DNA。虽然提取纯度高,但由于成本较高和操作时间较长,适用于对质量有较高要求的实验。
6) 其他方法
如离子交换法可利用质粒DNA与离子交换介质结合进行分离和纯化,超离心法则依赖于质粒DNA与其他分子密度的差异。
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