甘油是甘油三酯水解后的产物,作为游离脂肪酸的替代,甘油的含量可作为甘油三酯水解反应的有效检测指标,且更为便捷。本试剂盒经过优化,可用于检测实体组织和细胞中的甘油含量,其线性范围为10-1200µmol/L。
检测原理
在ATP的存在下,甘油通过甘油激酶被磷酸化,转化为3-磷酸甘油,继而由甘油磷酸氧化酶氧化生成过氧化氢。在过氧化物酶的催化作用下,生色底物被转化为苯基胺,其光密度值与甘油浓度呈正比。
适用范围
本试剂盒适用于测定实体组织及细胞中的甘油浓度。
试剂盒组成
本试剂盒可进行105次微板测定或30次1ml比色杯测定,主要包括:
- 裂解液50ml
- R1试剂16ml
- R2试剂4ml
- 4mmol/L甘油标准品1ml(4ºC保存,有效期6个月)
所需设备
需配备酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。最佳工作波长为550nm,若无此波长,可优先选用570nm,其次选530或490nm。
样本准备
细胞裂解
消化并离心收集细胞,或在培养皿内直接裂解。一般在6孔板中,每孔约需2x106个细胞,75cm2瓶约1x107个细胞。每1~2x106个细胞加0.1ml裂解液,震荡后静置10分钟。
动物组织裂解
需在新鲜组织剪切并称重后保存,避免组织冻存后再解冻造成显著测量误差。使用减量称重法计算组织重量(约100mg),强烈建议每1mg组织加10µl裂解液以减少变异。使用适当的匀浆器快速裂解,随后静置10分钟。
裂解液处理
- 取适量上清液转移至15ml离心管中,执行下一步操作。剩余裂解液可用于BCA法进行蛋白定量或储存于-20ºC。
- 在270ºC加热10分钟以灭活脂肪酶,可能产生沉淀。
- 室温下5000rpm离心5分钟,上层清液可用于酶学测定。
工作溶液配制
按4:1比例,将4ml R1试剂与1ml R2试剂混合,立即使用或在4ºC条件下保存不超过1天。注意防止甘油被污染。
标准品稀释
使用蒸馏水、生理盐水或与样品相同缓冲液将4mM甘油标准品稀释为不同浓度(1000、500、250、125、625、312.5、156.25、78.125µmol/L),通常选择4~6个浓度管,同时设置0浓度对照管。
甘油测定
- 根据下表加样,待测样品体积为10µl,过量可能抑制反应。于37ºC或25ºC反应10分钟。
- 反应平衡后,颜色在60分钟内保持稳定。
- 使用蒸馏水加工作液的空白管进行零点校准,测定各管OD值。
- 绘制标准曲线并计算甘油浓度。可使用Excel进行数据图表处理,将各标准管的OD值作为y轴,标准品浓度作为x轴。
最后,以每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油含量,让实验结果更具可靠性。选择尊龙凯时-人生就是博,为您的实验提供更优秀的产品与服务。