甘油是甘油三酯水解后的产物，作为游离脂肪酸的替代，甘油的含量可作为甘油三酯水解反应的有效检测指标，且更为便捷。本试剂盒经过优化，可用于检测实体组织和细胞中的甘油含量，其线性范围为10-1200µmol/L。

检测原理

在ATP的存在下，甘油通过甘油激酶被磷酸化，转化为3-磷酸甘油，继而由甘油磷酸氧化酶氧化生成过氧化氢。在过氧化物酶的催化作用下，生色底物被转化为苯基胺，其光密度值与甘油浓度呈正比。

适用范围

本试剂盒适用于测定实体组织及细胞中的甘油浓度。

试剂盒组成

本试剂盒可进行105次微板测定或30次1ml比色杯测定，主要包括：

1. 裂解液50ml
2. R1试剂16ml
3. R2试剂4ml
4. 4mmol/L甘油标准品1ml（4ºC保存，有效期6个月）

所需设备

需配备酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。最佳工作波长为550nm，若无此波长，可优先选用570nm，其次选530或490nm。

样本准备

细胞裂解

消化并离心收集细胞，或在培养皿内直接裂解。一般在6孔板中，每孔约需2x10⁶个细胞，75cm²瓶约1x10⁷个细胞。每1~2x10⁶个细胞加0.1ml裂解液，震荡后静置10分钟。

动物组织裂解

需在新鲜组织剪切并称重后保存，避免组织冻存后再解冻造成显著测量误差。使用减量称重法计算组织重量（约100mg），强烈建议每1mg组织加10µl裂解液以减少变异。使用适当的匀浆器快速裂解，随后静置10分钟。

裂解液处理

1. 取适量上清液转移至15ml离心管中，执行下一步操作。剩余裂解液可用于BCA法进行蛋白定量或储存于-20ºC。
2. 在270ºC加热10分钟以灭活脂肪酶，可能产生沉淀。
3. 室温下5000rpm离心5分钟，上层清液可用于酶学测定。

工作溶液配制

按4:1比例，将4ml R1试剂与1ml R2试剂混合，立即使用或在4ºC条件下保存不超过1天。注意防止甘油被污染。

标准品稀释

使用蒸馏水、生理盐水或与样品相同缓冲液将4mM甘油标准品稀释为不同浓度（1000、500、250、125、625、312.5、156.25、78.125µmol/L），通常选择4~6个浓度管，同时设置0浓度对照管。

甘油测定

1. 根据下表加样，待测样品体积为10µl，过量可能抑制反应。于37ºC或25ºC反应10分钟。
2. 反应平衡后，颜色在60分钟内保持稳定。
3. 使用蒸馏水加工作液的空白管进行零点校准，测定各管OD值。
4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度。可使用Excel进行数据图表处理，将各标准管的OD值作为y轴，标准品浓度作为x轴。

最后，以每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油含量，让实验结果更具可靠性。选择尊龙凯时-人生就是博，为您的实验提供更优秀的产品与服务。