TOPO克隆PCR产物的纯化与回收流程

在完成PCR反应后，首先需要对产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认是否存在目的片段的条带。推荐使用切胶回收的方法进行纯化，切胶时长建议控制在3分钟以内，以减少紫外线对DNA的损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收的DNA浓度，应确保其浓度≥30ng/μl，并再次通过电泳确认是否仅有目的条带。

连接目的片段至载体时，连接反应体系需要按照说明书进行操作，各组分投入体积应≥1μl；如浓度过高，可进行适度稀释。建议连接反应温度尝试在25°C或37°C，时间为5分钟，若克隆效果不佳或出现空载体/假阳性，可以考虑将时间延长至30分钟。

感受态细胞转化与涂板

对于连接产物的转化，推荐使用DH5α、Fast-T1等化学感受态细胞。重要的是，感受态细胞不可反复冻融，建议从-80°C取出后一次性使用。重组产物与感受态细胞的体积比例应为1:10，例如可将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。热激时间需按照感受态细胞的说明书进行操作。

检查平板的抗生素抗性时，需确保平板抗性与转化载体的抗性一致。进行菌液涂板时，先将菌液离心（2500×g，3分钟），吸去多余的LB培养基，保留100μl重悬液后全部涂板，或者根据需要吸取适量进行涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

挑选平板中大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落。建议挑取多个单克隆菌落进行鉴定分析。将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中充分溶解，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）的模板。推荐使用一对分别位于片段与载体上下游的引物进行PCR鉴定。

对于存在Amp/kana抗性的质粒模板，可以对目的片段进行切胶回收。

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